Tematy ćwiczeń z przedmiotu BIOLOGIA MOLEKULARNA dla studentów III roku kierunku Analityka Medyczna

1. Charakterystyka, pobieranie, przechowywanie i transport materiału biologicznego przeznaczonego do analizy kwasów nukleinowych (materiał przeznaczony do izolacji DNA w przypadku diagnostyki chorób dziedzicznych, nowotworowych oraz zakaźnych; materiał przeznaczony do izolacji RNA, roztwory stabilizujące RNA).

Podstawy metod izolacji kwasów nukleinowych (pierwotna obróbka materiału biologicznego, liza komórek i struktur wewnątrzkomórkowych, odseparowanie kwasów nukleinowych od innych makrocząsteczek komórkowych, wytrącenie kwasów nukleinowych z roztworów) i przechowywanie wyizolowanych cząsteczek.

2. Izolacja DNA oraz spektrofotometryczna ocena stężenia  i jakości cząsteczek (metody izolacji – fenolowanie, kolumienkowa, magnetyczna; komercyjne zestawy do izolacji DNA, izolacja automatyczna. Właściwości spektrofotometryczne kwasów nukleinowych, ocena stężenia i czystości roztworów DNA).

Samodzielna praca studenta – izolacja DNA z krwi metodą kolumienkową i ocena otrzymanego roztworu na aparacie NanoDrop.

3. Izolacja RNA oraz elektroforetyczna ocena stężenia i jakości cząsteczek (przygotowanie tkanki do izolacji RNA, metody izolacji RNA – fenolowanie, kolumienkowa, magnetyczna; komercyjne zestawy do izolacji RNA, izolacja automatyczna. Spektrofotometryczna ocena stężenia i czystości roztworów RNA. Elektroforeza kwasów nukleinowych – podstawy i rodzaje elektroforezy, nośniki i bufory elektroforetyczne;

Samodzielna praca studenta – izolacja RNA z mrożonej tkanki płuca metodą kolumienkową i ocena otrzymanego roztworu na aparacie NanoDrop. Elektroforeza roztworów DNA i RNA.

4. Reakcja PCR – podstawy metody (skład mieszaniny reakcyjnej, profil termiczny reakcji, projektowanie starterów reakcji, praca z bazami genów). Reakcja odwrotnej transkrypcji (podstawa metody, stosowane startery i polimerazy).

Samodzielna praca studenta – zaprojektowanie starterów dla wybranego fragmentu genomu człowieka (KRAS) oraz genomu wirusowego (CMV). Nastawienie reakcji PCR oraz odwrotnej transkrypcji ze starterami nieswoistymi.

5. Reakcja PCR – analiza produktów amplifikacji. Rodzaje PCR i ich zastosowanie (wykorzystanie elektroforezy do analizy produktów amplifikacji, swoiste i nieswoiste produkty amplifikacji, czułość i swoistość amplifikacji, rodzaje PCR, analiza analityczna i preparatywna).

Samodzielna praca studenta – wykonanie elektroforezy produktów amplifikacji i analiza otrzymanych wyników.

6. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, RT-PCR) – podstawy metody (dynamika reakcji PCR, metody znakowania syntetyzowanego produktu PCR – barwniki interkalujące i swoiste sondy; pomiar fluorescencji w czasie reakcji, aparaty do real-time PCR, gotowe mieszaniny reakcyjne i zestawy startery/sonda do reakcji).

Samodzielna praca studenta – zaprojektowanie i nastawienie reakcji RT-PCR w kierunku oceny ilościowej wiremii wirusa CMV.

7. Zastosowania PCR w czasie rzeczywistym do oceny ilościowej wybranego fragmentu DNA (analiza z krzywą wzorcową) (zastosowanie analizy ilościowej w diagnostyce molekularnej, ocena amplifikacji – pojęcie progu i wartości Ct reakcji, parametry krzywej wzorcowej).

Samodzielna praca studenta – analiza amplifikacji fragmentu genomu wirusa CMV techniką RT-PCR. Obliczenie wiremii. Zaprojektowanie i nastawienie reakcji RT-PCR dla mRNA ludzkiego genu.

8. Zastosowanie PCR w czasie rzeczywistym do badań nad ekspresją genów (analiza względna) (jedno- i dwuetapowy proces amplifikacji mRNA techniką RT-PCR, charakterystyka procesu amplifikacji, konieczność normalizacji wyników, obliczenie względnej ekspresji analizowanego genu – metoda deltadeltaCt). Ocena liczby kopii genu w komórce metodą analizy względnej.

Samodzielna praca studenta – analiza przebiegu amplifikacji mRNA, obliczenie względnej ekspresji badanego genu. Zaprojektowanie i nastawienie reakcji RT-PCR w kierunku oceny liczby kopii genu MET oraz wykrywania polimorfizmu typu SNP metodą Allelic Discrimination.

9. Wykrywanie wariantów genetycznych (mutacji i polimorfizmów) – wykrywanie znanych mutacji (pojęcie znanego wariantu genetycznego, najczęściej stosowane metody diagnostyczne – elektroforeza poliakryloamidowa (PAA), RFLP, ASO, allelic discrimination; enzymy restrykcyjne i technika RFLP) .

Samodzielna praca studenta – Obliczenie liczby kopii genu MET za pomocą programu CopyCaller oraz genotypowanie badanego SNP. Nastawienie reakcji trawienia produktu amplifikacji I eksonu genu KRAS enzymem restrykcyjnym BstOI

10. Wykrywanie nieznanych wariantów genetycznych (mutacji i polimorfizmów) – techniki przesiewowe i sekwencjonowanie DNA (wysoce rozdzielcza analiza topnienia DNA – HRMA i inne metody przesiewowe, sekwencjonowanie metodą terminacji syntezy łańcucha – Sangera, automatyczne sekwenatory DNA i analiza elektroforegramów, pirosekwencjonowanie).

Samodzielna praca studenta – oczyszczanie i nastawienie reakcji sekwencjonowania produktu amplifikacji I eksonu genu KRAS, oczyszczanie produktu sekwencjonowania i wykonanie sekwencjonowania na aparacie 3500 Genetic Analyzer.

11. Wysoceprzepustowe metody sekwencjonowania DNA – sekwencjonowanie DNA nowej i trzeciej generacji. Metody bioinformatyczne opracowywania otrzymanych wyników sekwencjonowania.

Samodzielna praca studenta – analiza otrzymanych sekwencji I eksonu genu KRAS, porównanie sekwencji z sekwencjami w bazach genowych z użyciem programu BLASTN.

12. Techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych (podstawa i rodzaje techniki hybrydyzacji - hybrydyzacja in situ  (ISH), porównawcza hybrydyzacji genomowa (CGH) oraz mikromacierzy DNA. CGH z zastosowaniem mikromacierzy (aCGH), wykorzystanie sond w innych badaniach molekularnych – np. RT-PCR).

Samodzielna praca studenta – Zaprojektowanie eksperymentu aCGH, analiza wyników aCGH za pomocą programu CytoGenomics.

13. Analiza ekspresji genów za pomocą mikromacierzy (macierzy ekspresyjne i miRNA, postępowanie przy wykonaniu analizy, opracowywanie wyników, analiza bioinformatyczna)

Samodzielna praca studenta – zaprojektowanie eksperymentu analizy ekspresji genów techniką mikromacierzy, wykonanie wstępnej analizy za pomocą programu Feature Extraction

14. Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych i transformacja komórek bakteryjnych (przygotowanie wektorów i wstawek, wykorzystanie enzymów restrykcyjnych, wektory do klonowania, techniki wprowadzenia wektorów do komórki, weryfikacja transformacji).

Samodzielna praca studenta – przygotowanie wektora i wstawki do klonowania i wykonanie ligacji. Transformacja komórki bakteryjnej. Weryfikacja transformacji.

15. Podstawy diagnostyki molekularnej. Zaliczenie końcowe