Ćwiczenie 1 

1. Sprawdzian wiadomości z Immunologii.

2. Zasady BHP.

3. Podstawowe grupy testów immunodiagnostycznych stosowane w praktyce klinicznej.

Prelekcja: Zasady doboru i zlecania testów immunodiagnostycznych – rejestracja zleceń, dokumentacja. Zasady pobierania i dystrybucji materiału do badań immunodiagnostycznych w zakresie odpowiedzi komórkowej i humoralnej.

Część praktyczna: Przygotowanie materiału do badań immunodiagnostycznych: izolacja populacji komórkowych, ocena żywotności, czystości wyizolowanych frakcji, określenie stężeń wyizolowanych populacji komórkowych.

Ćwiczenie 2 

Metody identyfikacji antygenów i przeciwciał w tkankach i we krwi – interpretacja wyników.

Zagadnienia:

1. Rodzaje materiału do badań immunohistochemicznych
2. Typy reakcji immunohistochemicznej:
   1. Reakcja bezpośrednia
   2. Reakcja pośrednia
   3. Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym
      i kompleksem enzym-antyenzym
   4. Reakcja z białkiem A
   5. Reakcja z awidyną i biotyną
3. Znakowanie przeciwciał: rodzaje znaczników, przykłady
4. Zastosowanie Immunohistochemii

Prelekcja: Immunohistochemia.

Część praktyczna: Ocena preparatów wykonanych techniką immunohistochemiczną.      

Ćwiczenie 3 

Ilościowe metody oznaczania antygenów i przeciwciał w tkankach i we krwi – interpretacja wyników.

Zagadnienia:

1. Metody immunoenzymatyczne: cechy ogólne i zasada metody.
2. Podział metod immunoenzymatycznych:
   1. Homogenne
   2. Heterogenne
      • Kompetycyjne
      • Niekompetycyjne
3. Etapy i zastosowanie metod:
   1. ELISA
   2. Sandwich ELISA
4. Charakterystyka metod:
   1. Test z „wyłapywaniem przeciwciała”
   2. Metoda ELFIA
   3. Test ELISPOT
5. Enzymatyczne znaczniki antygenów i przeciwciał.
6. Rola substratu w reakcji enzymatycznej, przykłady.

      Prelekcja: Techniki immunoenzymatyczne.

Część praktyczna: Oznaczanie stężenia cytokin metodą ELISA.

Ćwiczenie 4 

Ocena stężeń i składu krążących kompleksów immunologicznych (KKI) – interpretacja wyników.

Prelekcja: Metody oceny stężeń KKI.

Zagadnienia:

1. Kompleksy immunologiczne (KI):

   1. definicja,

   2. cechy ogólne,

   3. fizjologiczna rola,

   4. czynniki wpływające na patogenność KI,

   5. przewlekłe Tworzenie KI,

   6. mechanizm uszkodzenia tkanek przez KI.

2. Nadwrażliwość typu III wg Coombsa:

   1. cechy ogólne,

   2. efekty nadwrażliwości,

   3. postaci kliniczne, przykłady reakcji (płuco farmera, płuco hodowcy gołębi):

      • choroba posurowicza,

      • odczyn Arthusa,

      • reumatoidalne zapalenie stawów,

      • toczeń rumieniowaty układowy,

      • kłębuszkowe zapalenie nerek.

3. Metody oznaczania kompleksów immunologicznych:

   1. fizyczne,

   2. oparte na interakcjach ze składowymi dopełniacza,

   3. oparte na reakcji z czynnikiem reumatoidalnym.

4. Immunoelektroforeza:

   1. cechy ogólne,

   2. zastosowanie,

   3. czynniki wpływające na jej przebieg,

   4. nośniki/żele,

   5. rodzaje komór:

      • pionowa,

      • pozioma.

Część praktyczna:

1. Oznaczanie stężeń KKI metodą wytrąceniową.

2. Oznaczanie stężeń KKI metodą immunoelektroforezy.

3. Elektroforeza pozioma.

Ćwiczenie 5 

1. Metody oceny cytotoksyczności komórkowej – interpretacja wyników.

2. Czas przeżycia komórek – interpretacja wyników.

Prelekcja: Rodzaje testów oceniających cytotoksyczność. Rodzaje śmierci komórek. Metody oceny apoptozy

Zagadnienia:

1. Rodzaje cytotoksyczności:

   1. komórkowa zależna od przeciwciał – ADCC:

      • cechy ogólne,

      • przebieg,

      • komórki efektorowe,

   2. z udziałem układu dopełniacza,

   3. limfocytów Tc:

      • cechy ogólne,

      • wydzielane czynniki cytotoksyczne,

   4. komórek NK oraz makrofagów i granulocytów:

      • cechy ogólne,

      • wydzielane czynniki cytotoksyczne.

2. Metody oznaczania cytotoksyczności komórek:

   1. metoda nieizotopowa (morfologiczna),

   2. metoda izotopowa.

3. Oznaczanie aktywności cytotoksycznej związków chemicznych, przykłady i ogólna zasada metod;

   1. test cytotoksyczności MTT,

      • cel i zasada metody.

4. Apoptoza:

   1. rola apoptozy,

   2. przebieg procesu apoptozy, cechy apoptozy,

   3. regulatory apoptozy,

   4. cechy komórek apoptotycznych i nekrotycznych,

   5. białka uczestniczące w procesie apoptozy:

      • proapoptotyczne,

      • antyapoptotyczne,

      • kaspazy,

   6. stany kliniczne, w których następuje zahamowanie lub nasilenie procesu apoptozy.

5. Rodzaje technik wykorzystywanych w ocenie apoptozy.

6. Metody oceny apoptozy:

   1. analiza morfologiczna komórek,

   2. analiza fragmentacji DNA,

   3. badanie zaburzeń czynnościowych błony komórkowej,

   4. badanie procesów związanych z mitochondrium,

   5. wykrywanie aktywacji kaspaz.

Część praktyczna:

1. Wykonanie testu cytotoksyczności MTT.

2. Ocena apoptozy metodą fluorescencji.

3. Ocena apoptozy metodą cytometrii przepływowej

Ćwiczenie 6 

Badania komórkowe w oparciu o metody biologii molekularnej na poziomie białka.

Prelekcja: Technika Western blot – interpretacja wyników.

Zagadnienia:

1. Western blot - ogólna charakterystyka metody, cel i zasada metody.
2. Przygotowanie materiału do oznaczeń metodą Western blot – izolacja białka.
3. Etapy techniki Western blot:
   1. elektroforeza,
   2. transfer,
   3. blokowanie,
   4. inkubacja z przeciwciałami,
   5. detekcja.
4. Zastosowanie metody Western blot.

Część praktyczna: Izolacja, rozdział i immunoblotting białek

Ćwiczenie 7 

Badania komórkowe w oparciu o metody biologii molekularnej na poziomie kwasów nukleinowych.

Prelekcja: Technika Northern blot i Southern blot – interpretacja wyników.

Zagadnienia:

1. Ogólna charakterystyka metod Hybrydyzacji kwasów nukleinowych na filtrach:
   1. Northen blot,
   2. Southern blot.
2. Metody izolacji kwasów nukleinowych: kolumnowe; z trizolem

3. Materiał do izolacji, ocena ilościowa i jakościowa preparatów DNA i RNA; 
4. Hybrydyzacja typu Norhern blot – charakterystyka etapów metody:
   1. 1. RNA denaturacja,
      2. elektroforeza w żelu,
      3. transfer na membranę,
      4. immobilizacja,
      5. prehybrydyzacja,
      6. hybrydyzacja,
      7. detekcja.
5. Etapy hybrydyzacji typu Southern blot.
6. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) – ogólna charakterystyka.
7. Microarray – Mikromacierz DNA, chip DNA – ogólna charakterystyka.

Część praktyczna: Izolacja kwasów nukleinowych z komórek systemu odpornościowego.

Ćwiczenie 8 

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych – interpretacja wyników.

Prelekcja: Metody wykorzystywane w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych.

Zagadnienia:

1. Metody stosowane w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych:
   1. wykrywanie autoprzeciwciał:
      • immunofluorescencja pośrednia,
      • metoda immunoenzymatyczna (ELISA),
      • Western blot/immunoblot,
      • techniki żelowe,
      • metody radioizotopowe,
   2. wykrywanie kompleksów immunologicznych w tkankach:
      • immunofluorescencja bezpośrednia,
      • immunohistochemia.
2. Charakterystyka immunofluorescencji pośredniej i bezpośredniej.
3. Charakterystyka przeciwciał przeciwjądrowych (ANA).
4. Podstawowe wzory fluorescencji.
5. Diagnostyka chorób narządowo nieswoistych:
   1. oznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych,
   2. oznaczanie przeciwciał przeciw cytoplazmie neutrofilów,
   3. biopsja.
6. Diagnostyka chorób narządowo swoistych:
   1. oznaczanie przeciwciał swoistych,
   2. oznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych,
   3. oznaczanie przeciwciał przeciw cytoplazmie neutrofilów,
   4. biopsja.
7. Oznaczanie czynnika reumatoidalnego (RF):
   1. charakterystyka ogólna RF,
   2. wartość kliniczna RF,
   3. test lateksowy.

Część praktyczna: Oznaczanie czynnika reumatoidalnego – RF.

Ćwiczenie 9 

Immunologia transplantacyjna – interpretacja wyników.

Prelekcja: Metody typowania antygenów HLA.

Zagadnienia:

1. Nomenklatura HLA.

1. genetyczna,
2. serologiczna.

2. Typy przeszczepów.
3. Kryteria do transplantacji, dawcy i biorcy.
4. Czynniki wpływające na wynik transplantacji.
5. Przeszczep komórek krwiotwórczych:

1. źródła komórek – dawcy: klasyczni, alternatywni; krew pępowinowa,
2. dobór dawcy – etapy:

• spokrewnieni,
• niespokrewnieni.

6. Metody genetyczne badania HLA:

1. SSP,
2. SSOP,
3. SBT.

7. Metody serologiczne badania HLA:

1. test mieszanej hodowli leukocytów,
2. test wg Terasaki.

Część praktyczna:

1. Dobór dawca-biorca.

2. Demonstracja testu mikrocytotoksycznego wg Terasaki.

Ćwiczenie 10 

Diagnostyka zaburzeń odpowiedzi swoistej komórkowej – interpretacja wyników.

Prelekcja: Podstawowe metody oceny odpowiedzi swoistej komórkowej.

Zagadnienia:

1. Podział niedoborów odporności (komórkowe, humoralne);

   1. pierwotne:

- odpowiedzi nabytej,

- odpowiedzi wrodzonej,

1. 2. wtórne.

Podstawowe metody oceny odpowiedzi swoistej komórkowej: 

              a.test transformacji blastycznej.

1. Stany kliniczne z zaburzeniem odpowiedzi swoistej komórkowej:

   1. ciężki złożony niedobór odporności (Severe Combined Immunodeficiency; SCID),

   2. zespół hiper IgM (HIGM),

   3. Zespół Wiskotta-Aldricha,

   4. Zespół Di George’a (CATCH22),

   5. defekt receptora dla IL-12 i INF-γ,

   6. ataksja-teleangiektazja,

   7. Zespół Nijmegen,

   8. Zespół Blooma.

Część praktyczna: Dobór i wykonanie odpowiednich testów immunodiagnostycznych.

Ćwiczenie 11

Diagnostyka zaburzeń odpowiedzi swoistej humoralnej – interpretacja wyników.

      Prelekcja: Podstawowe metody oceny odpowiedzi swoistej humoralnej.

Zagadnienia:

1. Ogólne cechy pierwotnych niedoborów przeciwciał.

2. Badania immunodiagnostyczne:

   1. podstawowe,

   2. zaawansowane.

3. Jednostki chorobowe z zaburzeniem odpowiedzi swoistej humoralnej:

   1. CVID,

   2. Izolowany niedobór IgA (SIgAD),

   3. Niedobory podklas IgG,

   4. Agammoglobulinemia związana z chromosomem X (Choroba Brutona),

   5. Przejściowa hipogammaglobulinemia,

   6. Zespół hiper-IgE (Zespół Hioba – HIES).

Część praktyczna: Dobór i wykonanie odpowiednich testów immunodiagnostycznych.

Ćwiczenie 12

Diagnostyka zaburzeń odpowiedzi nieswoistej komórkowej – interpretacja wyników.

Prelekcja: Podstawowe metody oceny odpowiedzi nieswoistej

Zagadnienia:

1. Podstawowe metody oceny odpowiedzi nieswoistej komórkowej – badania przesiewowe:
   1. morfologia krwi z mikroskopową oceną rozmazu,
   2. cytometria przepływowa – ocena receptorów CD16 i CD18,
   3. test chemotaksji,
   4. test adherencji,
   5. test fagocytozy,
   6. test NBT.
2. Wrodzone zaburzenia liczby granulocytów:
   1. zaburzenia różnicowania się komórek układu krwiotwórczego:

- zespół Kostmana,

- przewlekła łagodna rodzinna neutropenia,

- cykliczna neutropenia,

- hipogammaglobulinemie (zespół hiper-IgM, CVID, SCID),

1. 2. nieprawidłowości fenotypowe:

- zespół Shwachmana,

    - zespół Chediaka-Higashiego.

3. Zaburzenia funkcji granulocytów:
   1. przewlekła choroba ziarniniakowa,
   2. niedobór mieloperoksydazy,
   3. zespół Chediaka-Higashiego,
   4. defekty adhezji leukocytów – LAD I, LAD II,
   5. niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD).

Część praktyczna: Dobór i wykonanie odpowiednich testów immunodiagnostycznych.

Ćwiczenie 13 

Diagnostyka zaburzeń odpowiedzi nieswoistej humoralnej – interpretacja wyników.

Prelekcja: Podstawowe metody oceny odpowiedzi nieswoistej

Zagadnienia:

1. Niedobory składników dopełniacza:

1. uwarunkowania genetyczne,
2. wskazania do podejrzenia niedoborów układu dopełniacza.

2. Badania przesiewowe oceny układu dopełniacza:

1. badanie całkowitej aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50, total serum hemolytic complement assay),
2. badanie alternatywnej aktywności hemolitycznej dopełniacza (AF50, alternative serum hemolytic assay),
3. ocena stężeń poszczególnych składowych C.

3. Niedobory białek kaskady dopełniacza:
   1. C1q, C1r, C1s, C2, C4,
   2. C3,
   3. Czynniki H, I,
   4. C5, C6, C7, C8, C9,
   5. MBL.
4. Niedobory białek kontrolujących aktywację:

1. C1 inhibitora,
2. czynnika C properdyny,
3. czynnika D lub I,
4. CD55, CD59.

5. Diagnostyka niedoborów w układzie dopełniacza.

Część praktyczna: Dobór i wykonanie odpowiednich testów immunodiagnostycznych.

Ćwiczenie 14 

Diagnostyka niedoborów mieszanych – dobór testów i interpretacja wyników.

Prelekcja: Podstawowe metody oceny odpowiedzi immunologicznej w mieszanych niedoborach odpornościowych.

Zagadnienia:

1. Przypomnienie podstawowych metod oceny odpowiedzi:
   1. swoistej komórkowej,
   2. swoistej humoralnej,
   3. nieswoistej komórkowej,
   4. nieswoistej humoralnej.
2. Niedobory odporności o charakterze mieszanym.

Część praktyczna: Dobór i wykonanie odpowiednich testów immunodiagnostycznych.

Ćwiczenie 15 

1. Zasady pracy laboratorium immunologicznego – zgodne z „Dobrą Praktyką Laboratoryjną”

2. Zasady posługiwania się aparaturą stosowaną w immunodiagnostyce, postępowanie w przypadku awarii.

3. Sprawdzian pisemny.

4. Egzamin praktyczny.