Podstawowe zagadnienia na zajęcia seminaryjne z BIOLOGII MOLEKULARNEJ dla studentów IV roku kierunku Farmacja

1. Organizacja genomów komórek bakteryjnych i eukariotycznych.

1. Kwasy nukleinowe jako cząsteczki informatyczne: budowa, właściwości fizyko-chemiczne i funkcje kwasów nukleinowych.
2. Pojęcie informacji genetycznej (genomu) oraz genu jako jednostki informacji genetycznej.
3. Właściwości kwasów nukleinowych umożliwiające ich funkcjonowanie jako biologicznych cząsteczek informatycznych (budowa, długość łańcuchów, swoiste oddziaływanie zasad, kopiowanie na zasadzie komplementarności, uniwersalność budowy). Podwójna helisa DNA.
4. Organizacja i funkcje chromatyny jąder komórek eukariotycznych. Histony i białka niehistonowe. Chromosomy mitotyczne.
5. Organizacja genomów komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Geny i sekwencje niekodujące. Sekwencje powtórzone w genomach. Genomika.
6. Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za utrzymanie stałości informacji genetycznej wewnątrz i między pokoleniami organizmów (replikacja i naprawa DNA).
7. Semikonserwatywny mechanizm replikacji DNA. Mechanizm molekularny syntezy nowych nici kwasów nukleinowych przez polimerazy DNA i RNA – matrycowy charakter syntezy, kierunek syntezy od 5’-końca do 3’-końca. Startery reakcji. Aktywność korygująca polimeraz DNA. Regulacja procesu replikacji DNA.
8. Uszkodzenie DNA spontaniczne i pod wpływem czynników mutagennych. Modyfikacje chemiczne nukleotydów i pęknięcia w niciach DNA. Metylacja DNA katalizowana przez wyspecjalizowane enzymy i jej rola w regulacji procesów molekularno-genetycznych. Układy naprawy DNA.

2. Ekspresja genów

1. Realizacja informacji genetycznej w komórce – ekspresja genów. Centralny dogmat biologii molekularnej. Geny kodujące polipeptydy i funkcjonalne cząsteczki RNA. Kod genetyczny, jego właściwości. Budowa genu (sekwencje regulatorowe i kodujące, promotory genów, nieciągłość większości genów wyższych eukariotów). Wielkość genów ludzkich. Zależność pomiędzy wielkością genu a ilością  intronów.
2. Główne etapy ekspresji genów (transkrypcja, dojrzewanie pierwotnych transkryptów, translacja, modyfikacje posttranslacyjne białek). Synteza RNA w procesie transkrypcji przez polimerazy RNA. Polimerazy RNA komórek bakteryjnych i eukariotycznych.  Rozpoznawanie promotorów przez podstawowe czynniki transkrypcyjne. Zapoczątkowanie transkrypcji. Podstawowe procesy dojrzewania RNA (modyfikacje końców RNA, splicing intronów, modyfikacje chemiczne nukleotydów). Udział funkcjonalnych cząsteczek RNA w procesach dojrzewania pierwotnych transkryptów.
3.  Regulacja ekspresji genów.  Poziomy regulacji. Udział czynników transkrypcyjnych i procesów epigenetycznych (metylacja promotorów i modyfikacja histonów) w regulacji transkrypcji. Alternatywny splicing. Redagowanie mRNA. Regulacja stabilności mRNA (udział miRNA).
4. Jak działają czynniki transkrypcyjne? Sekwencje wzmacniające i wyciszające transkrypcję. Molekularne podstawy różnicowania tkankowego organizmów wielokomórkowych oraz rozwoju osobniczego organizmu. Powiązanie procesów regulacji ekspresji genów z sygnalizacją komórkową. Mechanizm molekularny regulacji stabilności mRNA przez miRNA.

3. Zróżnicowanie genetyczne

1. Stopień zróżnicowania genetycznego wewnątrzgatunkowego (na przykładzie genomu ludzkiego – wyniki Projektu Poznania Genomu Człowieka –Human Genome Project, HGP). Przyczyny pojawienia się różnic w sekwencji nukleotydów w DNA – mutacje i dobór naturalny. Co nazywamy mutacją?  Mechanizmy molekularne mutagenezy - samoistne i indukowane błędy replikacji DNA, czynniki genotoksyczne i uszkodzenie DNA, błędy homologicznej rekombinacji genetycznej, rekombinacja niehomologiczna (transpozycja genetyczna), błędy podziału komórkowego.
2. Rodzaje mutacji oraz fenotypowe skutki mutacji na poziomie komórki i organizmu wielokomórkowego (zależność od miejsca, wielkości i rodzaju zmiany, wpływ kodu genetycznego i nieciągłego charakteru genów – substytucje synonimiczne i zmiany sensu, mutacje nonsensowne i zmiany ramki odczytu, mutacje splicingowe i regulatorowe). Jak mutacja staje się polimorfizmem genetycznym?  Polimorfizmy genetyczne i mutacje  (w tym chorobotwórcze) są wariantami genetycznymi. Podstawowe typy polimorfizmów genetycznych – polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (single nucleotide polymorphisms, SNPs), polimorfizmy długości fragmentów (sekwencje mikro- i minisatelitarne), polimorfizmy liczby kopii (copy numer variations, CNVs)
3.  Pojęcie choroby genetycznej i wrodzonej podatności na chorobę. Udział alleli polimorficznych w powstawaniu chorób oraz wrażliwości na leki. Genetyczny „paszport” człowieka.

Farmakogenetyka i farmakogenomika. Polimorfizm genów związanych z metabolizmem leków.

4. Podstawowe techniki analizy kwasów nukleinowych

1. Podstawowe techniki laboratoryjne analizy struktury (sekwencji nukleotydów) i funkcji (aktywności genów – ekspresji) kwasów nukleinowych. Analiza in situ oraz izolacja DNA i RNA, ocena jakości i stężenia kwasów nukleinowych w roztworach. Elektroforeza kwasów nukleinowych.
2. Powielenie (amplifikacja) wybranych fragmentów DNA i RNA techniką PCR i RT-PCR. Właściwości polimerazy DNA wykorzystane w reakcji PCR (zależność od matrycy, kierunek syntezy nowej nici). Znaczenie starterów reakcji PCR dla selektywnej amplifikacji DNA. Ocena ilościowa fragmentów DNA lub transkryptów techniką PCR w czasie rzeczywistym.
3. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych. Denaturacja termiczna (topnienie, ang. melting) i renaturacja DNA. Temperatura topnienia DNA, zależność od sekwencji nukleotydów. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – oddziaływanie komplementarnych cząsteczek i utworzenie hybrydowej cząsteczki. Pojęcie sondy hybrydyzacyjnej. Znakowanie hybryd radioaktywne, enzymatyczne lub fluorescencyjne. Wykorzystanie hybrydyzacji w technikach in situ (ISH, FISH) oraz mikromacierzach DNA.
4. Metody analizy sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych – metody wykrywania mutacji i wariantów polimorficznych. Mutacje znane i nieznane. Metody wykrywania mutacji znanych (RFLP – wykorzystanie enzymów restrykcyjnych, allelo-swoistych sond i starterów PCR) i nieznanych (metody przesiewowe i sekwencjonowanie DNA). Nowoczesne metody analizy genomów i transkryptomów komórek (sekwencjonowanie nowej generacji, mikromacierzy CGH).

5. Inżynieria genetyczna – technologia rekombinowanego DNA

1.   Manipulowanie kwasami nukleinowymi – technologia rekombinowanego DNA. Znaczenie uniwersalności informacji genetycznej w przyrodzie. Przepływ informacji genetycznej pomiędzy organizmami wewnątrz gatunku (rozmnażanie płciowe, cross-over) i między gatunkami (transpozycja genów wirusami).
2. Pojęcia klonu i klonowania. Klonowanie DNA – namnażanie wybranych fragmentów DNA w żywej komórce (in vivo) za pośrednictwem aparatu replikacyjnego tej komórki.

Otrzymywanie fragmentu DNA do klonowania (enzymy restrykcyjne, elektroforeza kwasów nukleinowych, blotting, izolacja DNA z żelu). Wektory do klonowania. Otrzymywania rekombinowanych wektorów. Wprowadzenie rekombinowego wektora do komórki-gospodarza (transformacja i transfekcja komórki). Skrining rekombinowanych komórek. Klonowanie RNA poprzez przepisanie na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Biblioteki DNA i cDNA i metody ich przeszukiwania.

3. Znaczenie klonowania DNA. Wykorzystanie klonowania do izolacji i badania genów. Mutageneza ukierunkowana – narzędzie do oceny funkcji genu. Wektory ekspresyjne i otrzymywanie białek rekombinowanych. Wykorzystanie bakterii do syntezy  białek eukariotycznych – klonowanie cDNA, swoiste wektory bakteryjne z „silnymi promotorami”, znaczenie mutagenezy ukierunkowanej do zaprogramowanej modyfikacji białek.
4. Organizmy transgeniczne i genetycznie zmodyfikowana żywność. Osiągnięcia biotechnologii molekularnej – otrzymywanie biofarmaceutyków, terapia genowa, interferencja RNA, rybozymy, otrzymywanie organów do przeszczepów.